發(fā)布時(shí)間 : 2020-06-24 閱讀次數(shù) : 124
elisa作為經(jīng)典的免疫檢測(cè)方法,看起來(lái)很平常,然而真正做好它并不容易.有哪些方法可以借鑒呢？我們總結(jié)了幾點(diǎn)：
1. 確定您的樣本類(lèi)型和試劑盒可以兼容
常見(jiàn)樣本類(lèi)型有血清,血漿,細(xì)胞培養(yǎng)上清,如果是廠家實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證過(guò)的,可根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明購(gòu)買(mǎi)使用.【注意：血漿制備用到的抗凝劑有 EDTA 檸檬酸鹽 肝素等多種,相應(yīng)的血漿性質(zhì)存在差異,需單獨(dú)確認(rèn)兼容性】.
2. 試劑盒檢測(cè)范圍需要匹配樣本中標(biāo)志物濃度
elisa試劑盒的定量檢測(cè)范圍需參考標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)最低和最高濃度區(qū)間內(nèi)屬于線(xiàn)性范圍,其中的值是可信和可定量的.濃度高于線(xiàn)性范圍的樣品要稀釋到線(xiàn)性范圍內(nèi)來(lái)測(cè)量,而濃度低于線(xiàn)性范圍的樣品,其測(cè)量值不能用于計(jì)算濃度,只能用做參考.有一種常見(jiàn)的相關(guān)情況是：健康人樣本中很多標(biāo)志物的濃度偏低,測(cè)量值低于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)最低值.
3. 樣本收集有講究
以血清為例,樣本收集可參考試劑盒說(shuō)明書(shū),但需注意以下要點(diǎn).樣本盡量用無(wú)菌管收集,避免細(xì)菌的酶類(lèi)和代謝產(chǎn)品對(duì)結(jié)果的影響.采集過(guò)程要避免溶血,因?yàn)榧t細(xì)胞溶解釋放的活性物質(zhì)可能會(huì)影響檢測(cè).保存過(guò)程中如有沉淀,應(yīng)離心后取上清液.樣本若不立即測(cè)定,建議按照每次使用量分裝保存在 -20℃,每次檢測(cè)使用一管,即避免交叉污染和反復(fù)凍融,有能保證檢測(cè)結(jié)果的平行可比性.
4. 實(shí)驗(yàn)前要準(zhǔn)備好相應(yīng)試劑
提前將所有試劑平衡到室溫環(huán)境,這個(gè)過(guò)程大致需半小時(shí)左右.洗液是濃縮液,如有結(jié)晶析出,需完全溶解后再進(jìn)行稀釋.A B 兩管顯色底物在使用前15分鐘按 1:1 配成混合液.為保證蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制質(zhì)量,蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為凍干粉,重溶前需將管子離心,加入說(shuō)明書(shū)指定的緩沖液,慢速在搖床上搖勻或顛倒混勻,至少 15 分鐘,不建議用槍頭吹打.溶解后如需保存,按每次使用量分裝后根據(jù)說(shuō)明書(shū)要求的溫度保存.梯度稀釋蛋白標(biāo)準(zhǔn)品時(shí),建議用聚丙烯管（對(duì)蛋白吸附力很低）,每步都要充分混勻且更換新槍頭,確保梯度準(zhǔn)確性.
5. 儀器設(shè)備的準(zhǔn)備也必不可少
相關(guān)設(shè)備包括移液器 洗板機(jī)/搖床和酶標(biāo)儀.移液器的準(zhǔn)確性對(duì)于ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性十分關(guān)鍵,需要確保定期校準(zhǔn)維護(hù).搖床的使用是為了讓反應(yīng)體系快速達(dá)到平衡,獲得穩(wěn)定 可重復(fù)的結(jié)果.不用搖床對(duì)實(shí)驗(yàn)通常的影響是,OD 值低,CV 大.酶標(biāo)儀等設(shè)備使用前提前 15 分鐘開(kāi)機(jī)預(yù)熱.
6. 剩余的試劑盒材料要妥善保存
標(biāo)準(zhǔn)品分裝后按說(shuō)明書(shū)要求的溫度保存,這樣可以避免污染,對(duì)要求冷凍保存的標(biāo)準(zhǔn)品還可以避免反復(fù)凍融；酶標(biāo)板放回錫箔紙袋,加入干燥劑,封緊封口,4℃保存.忌未將酶標(biāo)板完全平衡至室溫,就放回錫箔紙袋,因?yàn)榇藭r(shí)由于溫度差,酶標(biāo)板上會(huì)有水汽,不利于穩(wěn)定保存.
7. 預(yù)實(shí)驗(yàn)：通常預(yù)實(shí)驗(yàn)包括全部標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和小量樣本.
預(yù)實(shí)驗(yàn)有兩個(gè)主要目的,一來(lái)是熟悉實(shí)驗(yàn)流程,發(fā)現(xiàn)可能忽略的問(wèn)題；二來(lái)是測(cè)試樣本和試劑盒是否匹配,一旦出現(xiàn)不匹配的情況,不至于浪費(fèi)過(guò)多樣本.另外是對(duì)樣品中目的分析物的豐度作一下大致了解,以確定合適稀釋度.
8. 孵育時(shí)要保證溫度均勻,防止揮發(fā)變干
孵育時(shí)壓緊封口膜.多塊板一起實(shí)驗(yàn)時(shí),要平放各板,不要疊放,以免因溫度不均造成漂移或邊緣效應(yīng).
9. 加樣要快速準(zhǔn)確,避免氣泡
加樣時(shí)間宜控制在 15 分鐘內(nèi).加樣前要將樣本混勻,特別是凍存后融化的樣本（自然融化的血清等樣本會(huì)有分層現(xiàn)象）,應(yīng)上下顛倒充分混勻,注意動(dòng)作輕緩,避免產(chǎn)生氣泡.如凍存融化后的樣本有沉淀,可以再次離心.整個(gè)加樣過(guò)程都要注意避免產(chǎn)生氣泡.氣泡會(huì)影響蛋白的相互結(jié)合,而影響反應(yīng)進(jìn)行.
10. 手動(dòng)洗板的操作指南
加洗液要快速,沒(méi)有多道移液器可以使用洗瓶.洗液應(yīng)新鮮配制,以免被其他試劑污染,或染菌.加好洗液后浸泡 30s-1min.甩板倒液要迅速干脆.倒液后在吸水紙上拍板,選用無(wú)粉塵和碎屑的優(yōu)質(zhì)吸水紙.需要用力拍板,使孔內(nèi)沒(méi)有可見(jiàn)液體掛壁；但也不能太重,不能讓樣品干太久.酶標(biāo)板拍干后立即做后續(xù)的加液.
11. 顯色反應(yīng)的關(guān)鍵點(diǎn)
elisa試劑盒實(shí)驗(yàn)是個(gè)酶促底物顯色反應(yīng),隨時(shí)間增加,顯色變深,所以選擇最佳時(shí)間終止反應(yīng)是得到準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和樣本濃度的重要因素.終止過(guò)程要完全.使用的 TMB 底物時(shí)完全終止點(diǎn)是黃色,不會(huì)有任何程度的藍(lán)色或綠色,終止過(guò)程中必要時(shí)可以震蕩 96 孔板,或用槍頭抽吸混勻（終止液含強(qiáng)酸,避免腐蝕）.
